Projekte Virale Proteomik

Charakterisierung von CD81 Rezeptor-Interaktionen bei der Hepatozyten Invasion von Hepatitis C Virus und Plasmodium

Lokalisierung von SRFBP1 in humanen Hepatomzellen. SRFBP1 ist ein HCV Eintrittsfaktor, welcher mittels quantitativer Proteomik identifiziert wurde.

Hepatitis C Virus (HCV) und der Malaria Erreger Plasmodium falciparum nutzen beide das humane Transmembranprotein CD81, um Leberzellen zu infizieren. Dies ist bemerkenswert, da sich beide Pathogene hinsichtlich ihres molekularen Aufbaus, ihrer Übertragung und den von ihnen ausgelösten Krankheiten stark unterscheiden. Eine Gemeinsamkeit ist lediglich der enge Wirtstropismus, aufgrund dessen beide Erreger unter natürlichen Umständen nur Menschen infizieren. CD81 ist einer von mehreren Faktoren, die diesen Wirtstropismus festlegen. Wie CD81 den Eintritt von HCV und  Plasmodium in die Wirtszelle ermöglicht, ist unzureichend geklärt. Es wird, aufgrund fehlender Signaldomänen im CD81 Protein, angenommen, dass CD81 die Aufnahme von HCV und Plasmodium über Protein-Protein Interaktionen (PPI) mit Membran-nahen Signalmolekülen und Zytoskelettregulatoren initiiert.

In unserer bisherigen Forschung gelang es uns, 33 CD81 PPI in humanen Hepatomzellen zu identifizieren, wobei mindestens zehn von diesen CD81 Interaktionspartnern von HCV und Plasmodium benötigt werden, um Zielzellen erfolgreich zu infizieren.  Zu diesen Proteinen gehören der Epidermale Wachstumsfaktor Rezeptor (EGFR), eine Rezeptor-Tyrosinkinase, welche in Zusammenhang mit HCV Eintritt beschrieben ist, eine Ubiquitin-Ligase und eine Endopeptidase. Unser Ziel ist es, die molekularen Funktionen dieser Wirtsfaktoren umfänglich zu untersuchen. Mit verschiedenen Domänenmutationen in den Wirtsfaktoren versuchen wir aufzuklären, wie diese Proteine den Eintritt des Erregers ermöglichen. Gleichzeitig analysieren wir die Spezifität der gefunden Interaktionen. Dazu führen wir Infektionsstudien mit anderen umhüllten Viren, mit verschiedenen HCV Genotypen sowie mit humanen als auch Nager Plasmodium Spezies in CRISPR/Cas9 Knockout-Zelllinien für den jeweiligen Eintrittsfaktor durch. Zuletzt untersuchen wir, ob die Wirtsfaktoren zu dem engen Wirts-und Gewebetropismus von HCV und Plasmodium falciparum Sporozoiten beitragen. Diese Arbeit wird Gemeinsamkeiten und Unterschiede während des Eintrittes in Hepatozyten von zwei wichtigen humanen Erregern aufdecken und stellt eine erfolgsversprechende Strategie dar, um dringend benötigte Arzneimitteltargets im Kampf gegen Malaria aufzudecken.

Diese Arbeit wird finanziert durch die DFG (GE  2145/3-2).
Kooperationspartner: Olivier Silvie (INSERM, Paris, Frankreich), Felix Meissner (Max-Planck-Institut für Biochemie, Martinsried), Lars Kaderali (Universität Greifswald)

Identifizierung von Eintrittsfaktoren umhüllter Viren

Quantitative Proteomanalysen zum Studium von Virus-Wirtszell Interaktionen beim Zelleintritt.

Massenspektrometrie-basierte Interaktionsproteomik hat in den vergangenen Jahren stark an Sensitivität gewonnen und kann mittlerweile quantitative Daten liefern. Auf Grundlage der Expertise, die wir bei unseren Arbeiten an Hepatitis C Virus gewonnen haben, verwenden wir neueste Proteomiktechniken, um Zelloberflächenmoleküle zu finden, die von umhüllten Viren, wie Alphaviren, gebunden werden. Hierbei kombinieren wir speziell entwickelte Anreicherungsmethoden für Proteinkomplexe mit massenspektrometrischen Analysen. Dies erlaubt es uns einerseits, das Interaktom bekannter Eintrittsfaktoren wie des Tetraspanin-9 und TIM-1 mittel markierungsfreier Analyse zu bestimmen (‚label free quantification’, LFQ). Andererseits nutzen wir stabile Isotopenmarkierung von Aminosäuren in Zellkultur, um solche Proteine zu identifizieren, die mit viralen Hüllporteinen und Rezeptoren beim Zelleintritt interagieren (‚stable isotope labeling with amino acids in cell culture’, SILAC).

Unsere Kooperationspartner Dr. Felix Meissner und Prof. Matthias Mann sind führende Experten auf dem Gebiet der quantitativen Massenspektrometrie, so dass wir neueste Analysetechniken verwenden können. Langfristig streben wir an, eine Plattform zu entwickeln, mit Hilfe derer zelluläre Anheftungsfaktoren und Rezeptoren von Viren schnell und effizient identifiziert werden können. Mittels CRISPR/Cas9 Editing, RNA Interferenz und Blockierungsstrategien untersuchen wir in Folgeexperimenten die Funktion von Tetraspanin-9 und TIM-1 Interaktionspartnern beim Viruseintritt. Unser Hauptaugenmerk liegt derzeit auf dem humanpathogenen und Moskito übertragbaren Chikungunyavirus. Identifizierte Eintrittsfaktoren und Rezeptoren testen wir anschließend auf ihre Spezifität für unterschiedliche umhüllte Viren und ihre Expression in verschiedenen humanen Geweben. Zuletzt untersuchen wir, ob verwandte Proteine in Moskitos und Primaten, d.h. im Überträgerwirt und im Reservoirwirt, ebenfalls als Eintrittsfaktoren für Chikungunyavirus fungieren. Diese Arbeit wird beleuchten, wie Alphaviren Wirtszellen penetrieren und kann damit zur Entwicklung antiviraler Strategien beitragen. Wir erwarten zudem, dass unsere Forschung zukünftige Studien mit einer Reihe unterschiedlicher humanpathogener Erregern ermöglichen wird.

Kooperationspartner: Margaret Kielian (Albert Einstein College, New York, NY, USA), Christine Goffinet (TWINCORE, Hannover), Pierre-Yves Lozach (Universitätsklinikum Heidelberg), Charles M. Rice (Rockefeller University, New York, NY, USA)

HCV – Arenavirus Koinfektion und Modulation von angeborenen Immunmechanismen

Angeborene Immunantwort bei HCV Infektion und virale Ausweichmechanismen vermittelt durch die NS3/4A Protease. (Modifiziert von Weigel, Bruening, Gerold, Journal of Immunology Research, 2016)

HCV ist ein kleines, umhülltes RNA Virus und der Erreger der Hepatitis C. Das Virus verursacht chronische Infektionen in 71 Millionen Menschen weltweit und kann schwere Leberschäden auslösen, darunter Zirrhose, Fibrose und Leberkrebs. In vielen Ländern wird eine HCV Infektion nicht diagnostiziert und es ist davon auszugehen, dass in Westafrika eine hohe Prävalenz zu finden ist. In diesen Regionen kommt es auch zu Ausbrüchen hämorrhagischer Fieberviren, wie des Lassavirus. Da eine chronische Hepatits C Infektion den Immunstatus der Leber verändert, untersuchen wir in Zellkulturmodellen, wie sie sich auf eine sekundäre Infektion mit Arenaviren auswirkt. Insbesondere betrachten wir hierbei die Viruslast, zelluläre Immunerkennungsmechnismen und die Wirksamkeit von antiviralen Medikamenten. Diese Untersuchungen können helfen, Risiken einer zugrundeliegenden chronischen Hepatitis C während Arenavirus Ausbrüchen abzuschätzen.

Diese Arbeiten werden durch die Deutsche Leberstiftung gefördert (S1 63/10135/2017)

Kooperationspartner: Stefan Kunz (CHUV, Lausanne, Schweiz), Jan Münch (Universität Ulm)